摘要: 为了从细胞学角度研究大葱雄性不育的机理, 利用石蜡切片法对大葱雄性不育系及保持系花药与花粉发育过程进行比较研究。观察结果表明: 大葱雄性不育系和保持系的小孢子母细胞都能正常进行减数分裂, 四分体可以释放出小孢子。雄性不育系的花粉败育发生于单核小孢子时期, 具有单核败育的特征。观察发现大葱雄性不育系的小孢子有2 种败育类型: ( 1) 绒毡层细胞正常发育, 但中层细胞发生了延迟解体的现象, 小孢子时期仍然存在, 与逐渐缩小的药室一起挤压小孢子细胞成一染色极深的团块状物质; ( 2) 绒毡层提前解体, 不能提供小孢子发育所需的营养, 小孢子的细胞质和细胞核逐渐解体, 仅剩下内空的花粉粒。花粉败育不仅与绒毡层有关, 还与中层细胞密切相关。
关键词: 大葱; 雄性不育; 小孢子发育
大葱(Allium fistulosum L.) 是我国栽培的重要葱蒜类蔬菜之一。目前, 利用雄性不育系是生产大葱杂交种的唯一途径。20 世纪70 年代张启沛等[1]在大葱自然群体中发现了雄性不育株, 并认为在我国大葱地方品种中雄性不育广泛存在。山东农业大学和山东省章丘市农业局以章丘大葱中发现的雄性不育株为不育源, 育成雄性不育系, 不育株率在95% 以上, 并利用雄性不育系配制了一些杂交组合[2]。有关细胞质雄性不育的细胞学机理研究在拟南芥、大豆、水稻、油菜等作物上已有报道[3- 6], 但国内外对大葱雄性不育研究较少, 对其不育机理尚不十分清楚, 本试验以1 份大葱雄性不育系及其保持系为试材, 采用石蜡切片技术, 观察雄性不育系和相应可育保持系小孢子的发育过程, 探索大葱雄性不育系花粉败育的时期和方式, 以了解大葱的雄性不育细胞学特征及雄性不育机理, 为大葱雄性不育系的研究和应用提供一定的理论依据。
1 材料与方法
本试验以1 份大葱雄性不育系及其相应保持系( 从章丘大葱中选育而成) 花蕾作为研究材料, 于2005 年7 月24 日取不同生长发育期的花蕾按大小分级后迅速用50% 的FAA 固定液固定24 h, 逐级酒精脱水, 石蜡包埋, 采用常规石蜡切片法制片, 切片厚度10 !m, 番红固绿染色法染色, 用加拿大树胶封片。最后用Olympus BH- 2 型摄像生物显微镜和全色胶卷照相。
2 结果与分析
2.1 大葱可育系花药和小孢子发育过程的细胞学观察
正常可育大葱的花药有4 个花粉囊, 呈蝶形, 花蕾横切面呈三角形, 每一花蕾含有6 个花药, 每一花药4 室。一般将花药发育过程分为造孢细胞期、小孢子母细胞期、四分体期、单核小孢子期、花粉粒成熟期。观察表明, 大葱同一花内的不同花药或同一花药的不同药室, 小孢子母细胞减数分裂多不同步,可分别处于减数分裂各期或四分体期。同一药室,小孢子母细胞减数分裂多为同步。
2.1.1 造孢细胞期花药壁由4 种组织细胞层构成, 由外向内分别为表皮、药室内壁、中层、绒毡层,其中绒毡层细胞核大, 细胞质浓, 着色深( 图版1) 。
2.1.2 小孢子母细胞期早期花粉母细胞为多边形, 细胞核大, 具有1 个明显的大核仁且被染色较深, 初生壁上已产生胼胝质壁。随着花粉母细胞逐步进入减数分裂, 其间的孢间层逐渐溶解, 细胞相互分开, 变成圆球形。此期的绒毡层细胞较大, 呈四边形且狭长, 成圈状规则排列在小孢子母细胞周围, 有一些细胞为二核, 核大, 着色深且多核仁( 图版2) 。此时中层细胞扁平, 多数中层细胞已解体断裂。
2.1.3 四分体期减数分裂形成的四分小孢子由胼胝质所包围, 形成左右对称及十字交叉形的立体结构, 着色深( 图版3) 。
2.1.4 单核小孢子期减数分裂后, 包裹着四分小孢子的胼胝质壁解体, 释放出单个的小孢子。四分体小孢子分开时, 绒毡层细胞体积达最大。刚释放出来的小孢子细胞壁很薄, 细胞核位居细胞中央( 图版4) 。单核晚期, 花粉粒壁逐渐加厚且逐渐趋于圆球形, 着色较深, 分散于花粉囊中。此期, 绒毡层细胞开始自我解体。
2.1.5 花粉粒成熟期小孢子变圆, 绒毡层细胞消失, 成熟花药的药壁由表皮及具条纹加厚壁的药室内壁组成( 图版5) 。成熟后期, 花药在抗拉力弱的仅由薄壁细胞组成的药室内壁处纵向开裂, 使同侧的2 个花粉囊相连通, 花粉沿裂缝散出。
2.2 大葱不育系花药和小孢子发育过程的细胞学观察
大葱雄性不育系小孢子母细胞的形态与减数分裂活动正常, 能形成正常的小孢子细胞, 而且绒毡层的活动在此期也没有发生异常, 与可育系的绒毡层相似( 图版6) 。但绝大多数小孢子不能进一步发育成雄配子体而开始败育, 极少数可发育到二孢花粉初期或中期而败育。小孢子败育方式可分为以下2种类型:
2.2.1 败育Ⅰ型花药发育到单核小孢子时期, 组成花药药室的绒毡层像可育系一样正常发育, 适时解体, 在成熟花粉粒时期完全解体。但中层细胞则存在延迟解体的现象, 在单核小孢子时期仍然存在,在小孢子外围成1 圈。大部分的花药壁极度收缩和解体的绒毡层融合在一起, 与中层细胞一起压迫小孢子, 使之形成一染色极深的团块状物质( 图版7) 。开花时, 药室内壁细胞排列紧密不能像可育系一样药室开裂散放花粉, 使团块状小孢子存留在药室内部。最终花药瘪缩变形, 各药室扭曲极为严重。
2.2.2 败育Ⅱ型在单核小孢子期以前, 绒毡层与正常花药组织无异, 在四分体后期分泌出胼胝质酶来溶解包裹着减数分裂四分体的一层胼胝质壁, 释放出单倍体小孢子。但在单核小孢子早期, 绒毡层提前解体, 不能持续提供小孢子发育所需的营养物质。从四分体中释放出来的单核小孢子, 在早期即形成了明显的花粉壁结构, 晚期单核小孢子得不到正常发育所需的足够营养物质, 致使细胞质和细胞核相继降解, 细胞质染色淡, 核仁很小, 到成熟时核仁消失, 仅剩下内空的花粉壁外壳。此时, 成熟花药的药壁由表皮及具条纹加厚壁的药室内壁组成( 图版8) 。在花粉粒成熟晚期, 花药与可育系一样在药室内壁处纵向开裂, 花粉沿裂缝散出或者附着在花药内壁上, 只是散出的花粉为内空的无生命活力的花粉粒( 图版9) 。
3 讨论
3.1 大葱雄性不育系小孢子的败育时期
Laser 等[7]在总结前人研究的基础上提出: 植物雄性不育花药的败育可以发生在小孢子发育的每个时期, 雄性不育可能涉及不止一个机制; 单子叶植物花药败育多数在单核至双核期, 双子叶植物中大多数发生在四分体和小孢子形成期。席湘媛[8]曾报道大葱的花粉败育发生在具液泡的单核小孢子期早期, 这与本试验的观察结果有所差异。笔者观察发现大葱小孢子败育多发生在单核小孢子晚期, 这也
许是不同败育类型之间有所差异。综合前人研究和本试验结果可以看出, 不同作物的雄性不育系小孢子败育时期不同, 即使同一种作物, 其不同类型、不同来源的雄性不育系小孢子败育时期也不尽相同,可能受外界环境的影响比较大。但是, 正如Laser 所说, 败育发生在花粉发育的所有阶段, 只是有些差异明显, 有些差异不明显, 不易观察到。
3.2 有关花粉败育原因的探讨
关于植物雄性不育系小孢子的败育原因, 许多学者从解剖学、细胞学与代谢角度, 通过小孢子发育的营养供给途径等方面进行了探讨, 大多数将其败育归因于绒毡层的异常[9- 12]。
植物绒毡层的已知功能至少有3 个[13]: ( 1) 给产生小孢子的组织及小孢子提供营养; ( 2) 分泌出胼胝质酶溶解包裹着减数分裂四分体的一层胼胝质壁,释放出单倍体小孢子, 胼胝质酶的适时分泌在花粉发育中起着关键性的作用; ( 3) 产生生物合成花粉外壁的前体物。从本试验观察结果可以看出, 大葱可育的正常花药发育过程中, 在四分体形成期的绒毡层细胞质有浓缩的趋向, 染色最深, 核有时被覆盖,这时多数为双核。因此可得出结论, 四分体时期是积累营养的最佳时期, 这与席湘媛的研究结果一致14]。在单核小孢子时期, 绒毡层细胞适时解体, 及时提供花粉发育所需的营养物质并为花粉粒体积激增提供空间。而在大葱雄性不育系花药的发育过程中, 绒毡层细胞出现了提前或延迟解体的现象。
绒毡层细胞提早凋亡现象可能是由于绒毡层细胞的程序性死亡或细胞凋亡引起的[14]。这种程序化死亡过程如果紊乱, 会发生绒毡层细胞提早降解的现象, 最终导致小孢子在发育过程中不能从绒毡层获得足够的营养物质, 最后小孢子败育; 但也可能是由于不育基因在小孢子发育成熟前, 通过调控绒毡层细胞行为, 使其提前降解, 并产生了一些信号物质, 使未成熟小孢子中的一些致死基因表达, 引起小孢子发育异常, 导致花粉败育。但最终是不育相关基因致使绒毡层差异表达引起小孢子不能完成正常发育, 还是不育相关基因直接作用于小孢子, 引起其发育异常导致败育, 还有待于进一步研究。
Chauhan[9]观察到多种植物雄性可育系的药室内壁的条纹状加厚壁, 是在绒毡层细胞的原生质体彻底解体时发生的, 他支持De Fossard[15]关于绒毡层细胞内存在某种抑制药室内壁形成条纹加厚壁的观点。一些相应的雄性不育系及化学杀雄植物, 其绒毡层异常者, 药室内壁均不产生条纹加厚壁, 他认为条纹加厚壁的形成, 受绒毡层的调控。本试验观察显示, 败育Ⅰ型花药中, 绒毡层细胞未解体时药室内壁也产生了条纹加厚壁, 这与De Fossard 及Chauhan的观点有所不同。
在可育系花药的发育过程中, 中层细胞内贮藏的物质渐渐被其消耗而减少, 同时由于受到花粉囊内部细胞增殖和长大所产生的挤压, 中层细胞在四分体时期就解体而被吸收。而在本试验中, 可观察到一些雄性不育系花药的中层细胞有延迟退化的现象, 在单核小孢子期仍然存在一起, 与内缩的药壁组织压迫小孢子成一团块状。而且存留的中层细胞可能阻隔了小孢子细胞与药壁组织间的物质和信息交流, 导致小孢子败育。关于小孢子败育与绒毡层细胞的异常发育有紧密的联系在许多文献中都有报道, 但和中层细胞延迟解体有关系的则很少有报道。
参考文献
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