【摘要】 目的：研究小泛素相关修饰物泛素结合酶9（Ubc9）在结直肠癌中的表达及其与化疗药物敏感性之间的关系。方法：收集手术切除的结直肠癌及癌旁新鲜标本50例，腺瘤30例，免疫组化法检测Ubc9蛋白的表达，分析其表达与患者临床病理资料的关系。原代培养结直肠癌细胞，MTT法检测不同结直肠癌组织对顺铂及5-氟尿嘧啶的药物敏感性，分析Ubc9蛋白的表达与药物敏感性之间的关系。结果：Ubc9在结直肠癌中的表达均显著高于癌旁和腺瘤组织，差异均有统计学意义（P<0.05）；Ubc9蛋白的表达与患者的性别、年龄及分化程度均无关（P>0.05），与肿瘤的TNM分期及淋巴结转移均有关（P<0.05）；Ubc9蛋白的高表达与顺铂的耐药呈正相关（r=0.323，P<0.05），Ubc9蛋白的表达与5-氟尿嘧啶药物敏感性无显著相关性（r=0.283，P>0.05）。结论：Ubc9蛋白在结直肠癌中高表达，与患者的临床分期、淋巴结转移有关，与顺铂的耐药性呈正相关。
【关键词】 结直肠癌； 泛素结合酶9； 免疫组织化学
【Abstract】 Objective：To investigate the expression of ubiquitin-conjugating enzyme 9（Ubc9） in colorectal adenocarcinoma，and its relationship with the clinicopathological features and sensitivity of chemotherapeutic drugs.Method：The expression of Ubc9 in 50 colorectal adenocarcinoma，paracancerous specimens and 30 adenoma were detected by immunocytochemistry，and the sensitivities of the tumor to Cisplatin and 5-fluorouracil chemotherapeutic drugs were detected by MTT assay.Result：Ubc9 protein expression in colorectal adenocarcinoma was significantly higher than those in paracancerous and adenoma specimens（P<0.05）.The expression of Ubc9 was correlated with TNM stage and lymph node memtastasis（P<0.05），but was not correlated with sex，age and differential degree（P>0.05）.The expression of Ubc9 protein was positively correlated with the drug resistance of Cisplatin（r=0.323，P<0.05），and had no significant correlation with the sensitivity of 5-fluorouracil（r=0.283，P>0.05）.Conclusion：Ubc9 protein is highly expressed in colorectal cancer，which is related to clinical stage，lymph node metastasis and positive correlation with drug resistance of Cisplatin.
【Key words】 Colorectal adenocarcinoma； Ubiquitin-conjugating enzyme 9； Immunohistochemistry
First-author’s address：First Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.23.010
小泛素相關修饰物（small ubiquitin-related modifier，SUMO）是一种新发现的蛋白质翻译后修饰途径，在调节蛋白质的稳定和功能方面发挥着重要的作用，对细胞的增殖、分化、凋亡过程起重要作用[1]。SUMO途径需要激活酶、结合酶和连接酶共同参与，泛素结合酶9（ubiquitin-conjugating enzyme 9，Ubc9）是该途径的唯一结合酶。据报道：Ubc9在头颈部肿瘤、乳腺癌、肺癌等多种肿瘤组织中普遍高表达[2-4]，并且与抗肿瘤药物的化疗敏感性有关[5-6]，目前Ubc9在结直肠癌中的研究鲜见报道。本研究观察Ubc9在结直肠癌组织中的表达情况，分析其与结直肠癌常用化疗药物敏感性之间的关系，为结直肠癌的研究提供新的思路和实验依据。现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集山西医科大学第一医院普通外科2016年1-9月收治的经手术切除结直肠癌及癌旁（距瘤体边缘>5 cm）新鲜标本50例，腺瘤30例。标本收集要求不影响术后病理诊断，癌组织一部分组织用于细胞原代培养，另一部分固定包埋后用于免疫组化实验。所有患者均无家族史，未经任何放化疗，术后经组织病理诊断为结直肠腺癌。入组患者中：男29例，女21例；年龄47～82岁，中位年龄59岁；分化程度：高分化11例，中分化25例，低分化14例；TNM分期（美国抗癌联合会/国际抗癌联盟）：Ⅰ期9例，Ⅱ期23例，Ⅲ期18例；无淋巴结32例，有淋巴结转移18例。
1.2 免疫组织化学 石蜡切片4 μm于多聚赖氨酸处理的载玻片上，烤片机上60 ℃过夜，切片脱蜡至水后磷酸盐缓冲液洗片3次。于0.01 M、pH值6.4的枸橼酸缓冲液中高压修复10 min，磷酸盐缓冲液洗片3次，滴加山羊血清封闭，孵育15 min。滴加Ubc9一抗（Abcam公司，货号：ab21193，浓度1∶200），4 ℃过夜孵育。滴加生物素标记的二抗（北京中杉金桥公司），37 ℃箱孵育30 min；DAB显色5 min，自来水终止显色；苏木素复染30 s，封片；每次染色用PBS液代替一抗做阴性对照。Ubc9阳性细胞定位于细胞质或/和细胞核，免疫组化结果判定方法参考文献[7]：以阳性细胞百分比（0分，0～4%；1分，5%～24%；2分，25%～49%；3分，50%～74%；4分，>75%和染色强度（阴性0分，弱阳1分，中等阳2分和强阳3分）的乘积进行评分，评分<6分为低表达，≥6分为高表达。
1.3 细胞原代培养及药敏试验 电子天平称取新鲜组织1 g。青链霉素即用液反复冲洗，将组织剪碎置于清洁塑料EP管中尽量剪碎至稀糊状，加入
5 mL消化酶，恒温摇床37 ℃震荡孵育1 h，将组织消化液通过200目不锈钢滤网，1000 r/min离心滤液10 min，弃去上清。细胞计数板计数并调整细胞浓度至1×105/mL，将细胞悬液均匀接种到96孔板中，培养基采用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清），置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。培养24 h后替换含顺铂、5-氟尿嘧啶的培养基，浓度为血药峰值浓度[8]，每组设6个平行孔及对照组（无药物）。培养24 h后取出培养板，每孔加入MTT液20 μL（5 mg/mL），入培养箱继续培养4 h后，吸去液体，每孔加150 mL DMSO，室温轻摇5 min，立即置于酶标仪测定490 nm波长下吸光度值（A）。计算细胞生长抑制率（IR），IR（%）=1-试验孔A均值/对照孔A均值×100%。按照实体瘤体外敏感标准[9-10]，抑制率≥30%为敏感，<30%为耐药。
1.4 统计学处理 采用SPSS 18.0软件对所得数据进行统计分析，计数资料以率（%）表示，比较采用 字2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Ubc9在结直肠癌旁、腺瘤及腺癌组織中的表达 Ubc9在癌旁、腺瘤及结直肠癌组织中均有不同程度的表达，Ubc9在结直肠癌中的表达显著高于癌旁及腺瘤组织，差异有统计学意义（P<0.05），腺瘤及癌旁组织中Ubc9的表达比较差异无统计学意义（P>0.05），见图1和表1。
2.2 Ubc9蛋白的表达与结直肠癌临床病理资料的关系 通过对结直肠癌患者的临床病理资料分析发现，Ubc9蛋白的表达与患者的性别、年龄及分化程度均无明显关联（P>0.05），与肿瘤的TNM分期及淋巴结转移均有关（P<0.05），即TNM分期高及淋巴结转移的患者中Ubc9蛋白的高表达率越高，见表2。
2.3 药敏实验结果及其与Ubc9表达的关系 原代培养及MTT最终成功评价了42例结直肠癌细胞体外对顺铂及5-氟尿嘧啶的药物敏感性，其中对顺铂敏感者17例，耐药者25例；对5-氟尿嘧啶敏感者20例，耐药者22例。相关性分析发现：Ubc9蛋白的高表达与顺铂的耐药呈正相关（r=0.323，P<0.05），Ubc9蛋白的表达与5-氟尿嘧啶药物敏感性无显著相关性（r=0.283，P>0.05），见表3。
3 讨论
人Ubc9基因定位于16p13.3，编码含158个氨基酸的蛋白，1997年Ubc9被确定为SUMO化途径唯一的E2结合酶，可识别特异性的靶蛋白结合位点，在SUMO化修饰中发挥重要作用。Ubc9在恶性肿瘤中作用越来越受到关注，其参与的SUMO化过程在肿瘤的发生发展和预后中的重要作用[11]。
本研究首先观察了结直肠癌组织、癌旁组织及良性腺瘤组织中Ubc9蛋白的表达，结果显示，Ubc9在不同组织中均有不同程度的表达，但在结直肠癌组织Ubc9蛋白的高表达率显著高于癌旁及腺瘤组织，说明Ubc9的高表达可能参与了结直肠癌的发生发展。进一步分析发现Ubc9蛋白在TNM分期高以及淋巴结发生转移的结直肠癌组织中表达更高，说明Ubc9的高表达可能与结直肠癌的进展程度及预后相关。就可能的机制而言，目前的研究表明，Ubc9所参与的SUMO化的动态失衡与肿瘤关系密切，生理状态下SUMO化参与DNA的稳定性、细胞程序性死亡及癌基因的转录修饰等过程[12]，病理状态下的SUMO化在肿瘤的发生及演进具发挥一定作用，由此导致DNA结构稳定性破坏、细胞凋亡过程受阻及癌基因的过度转录等分子生物事件[13]，作为SUMO化的唯一E2结合酶，Ubc9的过表达对上述过程具有促进作用[14]，而肿瘤的发生发展与Ubc9上调两者之间何为因果目前尚无明确定论，但Ubc9在肿瘤中的普遍高表达是值得肯定的。
研究表明，抑制乳腺癌细胞MCF-7中Ubc9的表达可使抗癌药物托泊替康、顺铂及替尼泊苷的敏感性增加[15]，siRNA干扰Ubc9基因的表达可显著增强抗癌药对黑色素瘤细胞的凋亡诱导作用[16]，提示Ubc9可能与化疗药物的敏感性相关。本研究通过原代培养方式体外评价了50例结直肠癌对常用化疗药物顺铂及5-氟尿嘧啶的敏感性，结果显示：顺铂耐药率为59.5%，5-氟尿嘧啶耐药率为52.4%，结合免疫组化结果相关性分析发现：Ubc9蛋白的高表达与顺铂的耐药呈正相关，而与5-氟尿嘧啶药物敏感性无显著相关性，提示Ubc9的高表达可能参与了顺铂的耐药过程。目前Ubc9参与耐药的机制尚不明确，可能与Fas相关蛋白-死亡结构域相关蛋白（death domain associate protein，Daxx）的定位改变有关，通过Daxx介导的细胞凋亡来影响细胞对化疗药物的敏感性[17-18]。
总之，本研究初步探讨了Ubc9在结直肠癌中的表达情况及其与常用化疗药物敏感性之间的关系，为结直肠癌的研究提供了新的思路和实验依据。目前，已有以Ubc9为治疗靶点的相关研究报道，相信Ubc9有望成为肿瘤治疗的有效药物和基因靶点。
参考文献
[1] Lomeli H，Vazquez M.Emerging roles of the sumo pathway in development[J].Cell Mol Life Sci，2011，68（24）：4045-4064.
[2] Ronen O，Malone J P，Kay P，et al.Expression of a novel marker， ubc9， in squamous cell carcinoma of the head and neck[J].Head Neck，2009，31（7）：845-855.
[3] Alshareeda A T，Negm O H，Green A R，et al.Sumoylatian proteins in breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat，2014，144（3）：519-530.
[4] Moschos S J，Jukic D M，Athanassiou C，et al.Expression analysis of ubc9，the single small ubiquitin-like modifier（sumo）E2 conjugating enzyme，in normal and malignant tissues[J].Hum Pathol，2010，41（9）：1286-1298.
[5] Chen S F，Gong C，Luo M，et al.Ubc9 expression predicts chemoresistance in breast cancer[J].Chin J Cancer，2011，30（9）：638-644.
[6] Moschos S J，Smith A P，Mandic M，et al.Sage and antibody array analysis of melanoma-infiltrated lymph nodes：Identification of ubc9 as all important molecule in advanced-stage melanomas[J].Oncogene，2007，26（29）：4216-4225.
[7] Chen S F，Gong C，Luo M，et al.Ubc9 expression predicts chemoresistance in breast cancer[J].Chin J Cancer，2011，30（9）：638-644.
[8]薛暉，陈荣，李洁.HPLC法测定人血浆中顺铂的浓度及其药动学研究[J].中国药房，2012，23（38）：3593-3595.
[9] Loizzi V，Chart K，Osann K，et al.Survival outcomes in patients with recurrent ovarian cancer who were treated with chemoresistance assay-guided themotherapy[J].Am J Obstet Gynecol，2003，189（5）：1301-1307.
[10]魏文青，赵满仓，刘晶，等.MTT肿瘤药物敏感试验的方法学研究[J].临床肿瘤学杂志，2008，13（10）：871-874.
[11] Watts F Z.Starting and stopping sumoylafion.What regulates the regulator[J].Chromosoma，2013，122（6）：451-463.
[12] Eladad S，Ye T Z，Hu P，et al.Intra-nuclear trafficking of the BLM helicase to DNA damage-induced foci is regulated by SUMO modification[J].Hum Mol Genet，2005，14（10）：1351-1365.
[13] Li R，Wei J，Jiang C，et al.Akt sumoylation regulates cell proliferation and tumorigenesis[J].Cancer Res，2013，73（18）：5742-5753.
[14] He X，Rieeberg J，Pulukuri S M，et al.Characterization of the loss of sumo pathway function on cancer cells and tumor proliferation[J].PLoS One，2015，10（4）：e0 123 882.
[15] Mo Y Y，Yu Y，Ee P L，et al.Over expression of a dominant-negative mutant Ubc9 is associated with increased sensitivity to anticancer drugs[J].Cancer Res，2004，64（8）：2793-2798.
[16] Moschos S J，Smith A P，Mandic M，et al.SAGE and antibody array analys is of melanoma-infiltrated lymph nodes：identification of Ubc9 as an important molecule in advanced stage melanomas[J].Oncogene，2007，26（29）：4216-4225.
[17] Lieeiardello M P，Mullner M K，Dumberger G，et al.Notch 1activation in breast cancer confers sensitivity to inhibition of sumoylation[J].Oncogene，2014，34（29）：3780-3790.
[18] Hirohama M，Kumar A，Fukuda I，et al.Spectomycin b1 as a novel SUMOylation inhibitor that directly binds to SUMO E2[J].ACS Chem Biol，2013，8（12）：2635-2642.
（收稿日期：2017-03-20） （本文编辑：程旭然）
