材料
1.1 仪器 细胞培养箱MCO-175（日本Sanyo公司）；流式细胞仪6HT2L（美国Guava Easy Cyte公司）；BX50显微镜（日本Olympus公司）；超净工作台VD1320（哈尔滨东联技术开发有限公司）；高速冷冻离心机CR21（日本Hitachi公司）；凝胶成像仪及凝胶成像分析系统 GelDOC2000（美国Bio-Rad公司）。
1.2 材料 山慈菇提取物（沈阳药科大学植物化学教研室提供，纯度为98 %。称取50g山慈菇粉末先后加入500mL、400mL、300mL去离子水加热，冷却过滤，浓缩至200mL，加入95%乙醇冷藏洗涤，最后获得干粉6g，使用培养基配置成所需要的浓度）。胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；RPMI1640 培养液（Gibco生物工程有限公司）；0.5%二甲基亚砜、MTT（DMSO，美国Sigma公司）；Annexin V/PI凋亡试剂盒（南京凯基生物技术有限公司），Cyt-C抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体、Caspase-3抗体、β-actin、辣根过氧化物酶标记羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（美国Santa Cruz公司）；吸附（ELISA）试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）。
2 方法
2.1 人结肠癌细胞HT29的培养 将人结肠癌细胞株HT-29置于56℃、30min 10%胎牛血清、RPMI1640培养液中，于37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，每2～3天传代一次，留取对数生长期的细胞用于实验。
2.2 MTT法检测细胞抑制率 取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化并收集细胞，以RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/mL，接种于96孔培养板中，每孔0.1mL，在培养箱中培养24h使细胞贴壁。空白对照组加入培养基0.1mL，不同浓度的山慈菇提取物组以10、20、30mg/mL培养细胞24、48、72h后，吸弃各孔中培养液，每孔加入0.1mLMTT[含 5%磷酸盐缓冲液（PBS）]，在37℃下孵育4h后弃去上清，加入0.5%DMSO 0.1mL，振荡摇匀，室温放置10min。在0.1mL DMSO中发现蓝紫色的MTT甲臜沉淀物，使用ELISA法以酶标仪于490nm波长处测定OD值，计算细胞抑制率=（1-实验组OD值/空白对照组OD值）×100%。
2.3 流式细胞术检测细胞凋亡 取对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化并收集细胞，以RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/mL，接种于96孔培养板中，每孔0.1mL，移入培养箱中培养24h使细胞贴壁。以0（空白对照组）、10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后，每孔悬浮细胞用PBS洗2次，加入500μl Binding Buffer和FITC标记的AnnexinⅤ（20μg/mL）10μl和碘化丙啶（PI，50μg/mL）5μl，避光反应15min，采用流式细胞仪定量检测，计算凋亡率。
2.4 Western blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达 取对数生长期细胞，用RPMI1640培养液调整细胞密度至1×105个/mL，接种于6孔培养板中，每孔0.1mL，移入培养箱中培养24h使细胞贴壁。以0（空白对照组）、10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后，用裂解液抽提。根据蛋白提取试剂盒操作说明提取各组细胞总蛋白，将细胞的蛋白样品定量，变性；进行聚丙烯酰胺凝胶电泳；转膜；脱脂牛奶封闭2h；洗膜，加入Cyt-C、Bcl-2、Bax、Caspase-3 （稀释倍数1∶1000）的一抗以及β-actin（稀释倍数1∶1000）作为阳性对照，4℃过夜；加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1h，然后洗膜、风干；ECL发光显影。用凝胶图像分析系统进行数据分析。
2.5 统计学方法 采用SPSS 19.0 统计软件进行数据分析。计量资料以（x±s）表示，多组间的比较用单因素方差分析，两组之间比较用LSD法进行统计。P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 细胞抑制率的测定 MTT结果显示，随着时间与药物干预浓度的增加，山慈菇提取物对人结肠癌HT29细胞生长增殖的抑制率逐渐增加，差异有统计学意义（P<0.01），并且抑制作用呈时间、剂量依赖关系。见表1。
3.2 细胞凋亡率的测定 与空白对照组比较，10、20、30mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h后，细胞出现明显凋亡，并且随着山慈菇提取物浓度的增加，凋亡细胞的比例逐渐增大，差异有统计学意义（P<0.01），并呈剂量依赖性。见表2。
3.3 Western blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、 Caspase-3蛋白表达的测定 由图1可知，10、20、30 mg/mL山慈菇提取物培养细胞24h 后，山慈菇提取物可使Cyt-C、Caspase-3、Bax蛋白表达增强，而Bcl-2蛋白表达减弱，差异有统计学意义（P<0.05），并呈剂量依赖关系。
4 讨论
细胞凋亡是基因介导的主动发生的程序性死亡，在正常情况下细胞凋亡与增殖维持动态平衡[5]。细胞凋亡既可以出现在正常的生理过程中，也可以出现在多种疾病中，如肿瘤因关闭了线粒体的这一调控功能，使细胞凋亡减少出现细胞过度增殖现象[6]。因此肿瘤的发生不仅与细胞增殖失控相关，还与细胞凋亡密切相关[7]，中间牵涉很多促凋亡和抗凋亡细胞因子。随着对肿瘤细胞的凋亡和调控机制认识不断深入，选择性得抑制细胞增殖与诱导细胞凋亡是治疗恶性肿瘤的一个方向[8]。实验采用MTT法证明山慈菇提取物能够抑制人结肠癌HT29细胞的生长，并且抑制作用随着剂量的增加、时间的延长而增强。另外在细胞培养过程中，出现了大量的细胞凋亡，通过流式细胞仪检测的HT29细胞凋亡情况，结果表明，山慈菇提取物能够促进细胞凋亡，并且具有剂量依赖性。
凋亡是多基因严格控制的过程，包括Bcl-2家族、Caspase家族、癌基因C-myc、抑癌基因P53等。而Caspase家族的凋亡途径包括两条：①死亡受体介导的外源性途径（Fas-FasL）；②线粒体介导的内源性调亡途径。而Bcl-2家族成员又与线粒体介导的凋亡途径密切相关[9]。研究表明：细胞在外界以及DNA损伤等内部信号的刺激下将Bcl-2家族中的成员聚集在线粒体，在促凋亡与抑凋亡因子的作用下调节细胞色素C（Cyt-C）的释放，在胞浆中其与凋亡相关因子结合形成多聚体，激活Caspase-9，再激活其下游的Caspase-3，细胞发生凋亡[10-11]。Bcl-2作为抑凋亡基因，在生长因子受体介导的信号传导途径中起作用，其通过抑制细胞凋亡而参与肿瘤的发病。而Bax则与其相反，它能促进细胞凋亡[12]。若Bcl-2过表达，则与Bax形成异二聚体抑制细胞凋亡，若Bax过表达，则形成同源二聚体促进细胞凋亡[13]。另外，研究提出Bcl-2/Bax比率关系细胞凋亡，当比率增大时，细胞凋亡受到抑制[14]。本实验通过Western-blot法检测Cyt-C、Bcl-2、Bax、 Caspase-3在人结肠癌HT29细胞中蛋白的表达，来研究山慈菇提取物对细胞凋亡的影响。结果显示，山慈菇提取物通过提高Cyt-C、Bax、Caspase-3蛋白表达降低Bcl-2蛋白表达来诱导细胞凋亡。
综上所述，山慈菇提取物可以通过调节Cyt-C、Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白的表达来抑制结肠癌HT29细胞增殖，诱导细胞凋亡，从而发挥抗肿瘤作用。但本实验处于初步探讨阶段，仍需进一步加强山慈菇的实验研究，发掘山慈菇在肿瘤治疗中的作用。
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（编辑：穆丽华）
