王 磊 王艳红 武京治 李孟委
（1）中北大学信息与通信工程学院，太原 030051；
2）中北大学化学与化工学院，太原 030051；
3）中北大学前沿交叉科学技术研究院，太原 030051）
蛋白质是参与每一个生理相关的生物化学或生物物理过程的重要生物分子。实现蛋白质天然构象排列的内源性折叠途径与其生物活性密切相关，在阿尔茨海默病（Alzheimer"s disease，AD）中，β淀粉样蛋白（Aβ）在大脑中的积累是诱发神经元变性的主要早期事件，其特征是大脑中存在细胞外神经炎斑块和细胞内神经原纤维缠结，老年斑是最显著的病理特征之一［1-5］。老年斑是由Aβ 蛋白组成，这种蛋白质是通过β 分泌酶和γ 分泌酶切割淀粉样前体糖蛋白（APP）而产生许多氨基酸数量在39~43之间变化的同种异体，其中Aβ1-40是最丰富的，Aβ1-42是最有毒和最容易聚集的［6-9］。作为一种天然无序蛋白质，Aβ 蛋白构象处于无序和部分折叠状态之间的动态平衡，Aβ 蛋白构象主要取决于环境。在膜环境中，Aβ 蛋白倾向于形成α 螺旋构象，而在水溶液中，Aβ 蛋白构象成分主要有无规则卷曲和少量α螺旋或β折叠［10-11］。
计算生物物理学在原子水平上研究生物分子的结构和相互作用，计算模拟提供了对蛋白质行为的原子水平的描述，成为了揭示分子生物学内在机制的有力手段之一［12-15］。分子动力学模拟可以在原子尺度上探索蛋白质的结构变化，是对蛋白质结构动力学研究的一种手段。本文基于分子动力学仿真计算，模拟计算了Aβ 蛋白在水溶液环境条件下，不同间距的纳米金属狭缝结构中的蛋白质金属吸附状况，分析不同狭缝条件下蛋白质构象动力学特性。本文的结果可为研究微纳结构中蛋白质分子的动力学特性、生物传感器设计以及疾病诊断等提供参考。
1.1 分子动力学模拟
所用分子动力学（molecular dynamics，MD）模拟均采用GROMACS 5.0软件进行，计算资源选择北京超级云计算中心，使用内存256 G、CPU 64核并行计算，在模拟中水分子采用SPC 模型，蛋白质Aβ1-42 的晶体结构从蛋白质结构数据库（PDB ID：5OQV）获得［16］。如图1 所示，该蛋白质由42 个氨基酸组成，在图中用氨基酸英文缩写进行标注。本研究选取了该晶体结构中的单个Aβ蛋白单体作为初始模拟结构，采用Au（111）作为金原子层，使用GolP-CHARMM 力场研究金属界面的蛋白质吸附以及蛋白质构象转变，该力场使用实验和第一性原理数据进行参数化，可以和生物有机力场CHARMM相兼容，该力场包含金原子的动态极化、化学吸附以及sp2杂化碳原子与金原子之间的相互作用力［17-20］。在水溶液环境模拟中，首先将Aβ1-42 蛋白置于一个边长为7.5 nm 的立方体盒子中心，并使蛋白质的每个原子与盒子边界之间的距离均大于1.0 nm。向盒子中填充水分子。在狭缝结构溶液模拟中，首先将Aβ 蛋白置于7.5 nm×7.5 nm×n的长方体盒子中心（其中n在不同的模拟中为变量），并在盒子z轴两侧分别插入两层金原子层以形成狭缝结构，向盒子中填充水分子，并用3 个钠离子替代水分子以中和体系电荷。采用CHARMM力场处理原子间的相互作用，使用蛙跳算法求解粒子的运动方程，模拟过程中采用周期性边界条件，模拟系综为恒温恒压系综，使用Nose-Hoover热浴控制系统温度保持在300 K，温度弛豫时间为0.2 ps，使用Parrine-Rahman 压力耦合器控制系统压强在100 kPa，使用Particle-Mesh-Ewald方法处理静电相互作用，静电和范德瓦尔斯力的截断半径为1 nm，MD 模拟时长为30 ns，时间步长为2 fs。其中最后1 ns 的轨迹数据用于分析蛋白质构象和动力学特性。
Fig. 1 Amino acid composition of Aβ protein
Fig. 2 Protein molecular conformation in nanoslits with different distances
Fig. 3 RMSD of protein molecules in 4 systems
Fig. 4 RMSF values of alpha-C atoms of protein molecules in four systems
Fig. 5 Secondary structural changes in protein
Fig. 6 Protein conformations at 3 characteristic time points
Fig. 7 Time evolution of radius of gyration Rg of the protein
Fig. 8 Solvent accessible surface area analysis
1.2 均方根偏差（RMSD）
均方根偏差（root mean square deviation，RMSD） 是表征蛋白质构象变化的重要工具，RMSD是通过计算蛋白质结构相对于对照组的偏差的算术值得到：
式中N为原子数，rfinal(i)和rinitial(i)分别是原子i的最终坐标和初始坐标。
1.3 均方根波动（RMSF）
均方根波动（root mean square fluctuation，RMSF）为原子位置变化对于时间的平均，可以表征蛋白质氨基酸在整个模拟过程中的柔性和运动剧烈程度。
1.4 回旋半径（Rg）
回旋半径（radius of gyration，Rg）反映了原子根据质心的分布，可以用来是衡量蛋白质分子链的形状和整体大小的变化，Rg的计算公式如下：
其中N为蛋白质原子数，r(i)和rcenter分别为原子i和质心的坐标。
1.5 溶剂可及表面积（SASA）
蛋白质的功能性质在很大程度上取决于其表面特性，二级结构对蛋白质的表面性质起着重要的功能，因此二级结构的改变会引起蛋白质表面性质的改变，进而导致蛋白质功能的改变。溶剂可及表面积（solvent accessible surface area，SASA）可定义为溶剂和其他分子相互作用的表面积。溶剂可及表面积可以表征蛋白质结构变化对溶剂接触面积的影响。溶剂可及表面积计算公式如下：
Zi是界面i到中心的垂直距离，Li是圆弧到界面i的距离。
2.1 构象分析
图2 所示为Aβ1-42 经MD 模拟30 ns 后最终时刻分子的结构。由图2b 可见，在5.0 nm 狭缝宽度下，蛋白质分子链两端分别被两侧金原子层吸附。在5.5 nm狭缝宽度下，蛋白质分子全链被一侧金原子层完全吸附（图2c）。与水溶液环境相比（图2a），在5.0 nm 和5.5 nm 狭缝内，蛋白质构象发生显著变化。在进一步扩展狭缝宽度后，蛋白质分子构象逐渐向水溶液状态中自由活动过渡。图2d 所示为在8.5 nm 狭缝宽度下，蛋白质分子构象与水溶液环境下相似，蛋白质分子与金属层相互作用较小。
2.2 均方根偏差分析
Aβ1-42 在水溶液环境与不同狭缝宽度下均方根偏差的时间演化如图3 所示，结果表明，在30 ns的模拟过程中，Aβ蛋白达到了平衡状态，与在溶液环境相比（RMSD=3 nm），在宽度为5.0、5.5、8.5 nm 的狭缝内时，RMSD值分别减小到0.2、0.15、0.25 nm。由于金原子层对蛋白质分子的强相互作用，在5.0 nm 与5.5 nm 狭缝内，蛋白质分子分别被吸附在金属一侧和两侧，导致蛋白质构象迅速稳定下来。而在8.5 nm 狭缝时，金属层距离蛋白质分子较远，两者之间相互作用显著减弱，使该状态下蛋白质分子与水溶液环境下蛋白质分子比较相似。
2.3 均方根波动分析
RMSF是相比于平均构象，蛋白质中每一个氨基酸残基的相对位置变化，对蛋白质结构中残基的均方根波动分析表明了MD 模拟过程中残基的a-C原子的波动性和灵活性，蛋白质残基的波动情况在一定程度上反映了蛋白质在不同条件下的变性程度。由图4 可知，水溶液环境与8.5 nm 狭缝条件下，蛋白质构象RMSF值波动程度相似，说明在8.5 nm金属狭缝条件下蛋白质构象受金属层影响较小，水分子对蛋白质构象的影响是主要成分。而在5.0 nm狭缝条件下，蛋白质链两端RMSF值波动程度较小，而蛋白质链中部区域RMSF值波动程度明显增大，说明在金原子层的相互作用下，靠近两侧金属的蛋白质链两端被金属层吸附，残基波动较小，而远离金属层的蛋白质链中部区域残基波动较大。在5.5 nm狭缝条件下，蛋白质链完全贴附在一侧金原子层上，其蛋白质链受到金原子层的强相互作用，蛋白质构象RMSF值波动程度明显减小。
2.4 二级结构分析
蛋白质二级结构分类算法（define secondary structure of protein，DSSP）是蛋白质二级结构指定领域比较公认的标准，DSSP 是基于氢键的制定方法，它利用静电能量代替氢键能量并且通过近似计算得到氢原子坐标。蛋白质内部疏水环境的介电常数和蛋白质表面的介电常数差异很大，DSSP 并没有考虑残基所处的环境而将介电常数作为一个定值，另外由于氢键模式会有交叉重叠，因此DSSP会指出一些在几何上明显异常与不规则的二级结构。由图5 可知水溶液环境中与5.5 nm、8.5 nm 狭缝条件下蛋白质构象主要由转角（turn）、弯曲（bend）和卷曲（coil）组成。其中8.5 nm狭缝条件下13~17 号残基呈α 螺旋。而5.5 nm狭缝条件下蛋白质构象主要由无规则卷曲组成。在30 ns 模拟的最终阶段取3 个特征时间点26 ns、28.5 ns 以及30 ns 对4 种体系下蛋白质进行绘图（图6），在5.0 nm以及5.5 nm狭缝下，蛋白质构象已经趋于稳定，其构象被单侧或两侧金属的强相互作用所固定（附件视频S1，S2 分别Aβ 蛋白位于金纳米狭缝间距5.0 nm和5.5 nm条件下的运动轨迹）。而水环境体系和8.5 nm狭缝体系下，蛋白质整体构象稳定，但蛋白质链个别位置仍处于一种动态稳定状态。
2.5 回旋半径分析
在MD 模拟过程中，计算了Aβ 蛋白的回旋半径，其值越大表示蛋白质构象越松散，其值越小则构象越致密和稳定。图7 所示为稳定状态下10 ns内，不同间距狭缝中Aβ 蛋白的回旋半径。在水溶液环境和8.5 nm 狭缝体系中，Aβ 蛋白单体的的回旋半径是最低的，分别为1.1 nm 和1.2 nm；
而在5.0 nm 狭缝和5.5 nm 狭缝体系下，Aβ 蛋白单体的回旋半径升高至1.90 nm，该数据表明Aβ蛋白结构已经发生了剧烈的变化，这一结果与RMSF的分析结果保持一致。结果说明，随着狭缝尺度的急剧缩小，蛋白质构象由致密变成松散状态，在一定狭缝尺度上，蛋白质出现不同程度的变性。
2.6 蛋白质构象的溶剂可及表面积（SASA）分析
SASA是描述蛋白质与水溶液接触的表面积的物理量，由于狭缝结构能够对蛋白质进行吸附进而对其构象造成较大的影响，因此计算了不同狭缝体系下Aβ蛋白单体的SASA随着时间的变化（图8）。在5.0 nm 狭缝和5.5 nm 狭缝体系下，Aβ 蛋白单体的SASA基本相同，而明显大于8.5 nm 狭缝和只有水溶液时的情况。因此，狭缝的吸附和拉伸作用将增加蛋白质的溶液可及面积。
金属狭缝结构对蛋白质的吸附作用会导致不同的蛋白质构象，研究结果表明，对于Aβ蛋白分子，当狭缝金属结构间距小于5 nm 时，蛋白质分子受到金属界面的较强吸附作用，与狭缝两端界面都发生作用，蛋白质分子发生变性，构象产生明显的变化。当狭缝间距约为5.5 nm 时，蛋白质分子只受到一侧金属界面吸附作用。当狭缝金属间距大于8.5 nm时，两侧金属界面距离蛋白质分子较远，金属对蛋白质构象影响程度随着狭缝间距增大而减小，蛋白质分子构象主要由溶剂决定。金属纳米狭缝结构与蛋白质分子的相互作用导致的蛋白质构象变化，可为生物分子动力学、微纳传感器及疾病检测等应用提供参考。
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